1. 小鼠骨髓细胞的获得

1.1 小鼠(6~8周)颈椎脱臼法处死，将处死的小鼠放于含有酒精的小烧杯中浸泡2 min，消毒灭菌，在超净台中手术取出所有的胫骨和股骨，并用剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净；

1.2 将取好的骨头转移到装有无菌PBS的培养皿中，涮洗一次后转移至另一个装有无菌PBS的培养皿；

1.3 用剪刀剪去骨的两端，再用注射器抽取PBS，针头分别插入两端骨髓腔中，用注射器打入PBS，反复冲洗骨髓至培养皿中，直至骨完全变白；

1.4 收集骨髓悬液，用筛网过滤去除小碎片和肌肉组织；

1.5 将滤过液500×g/5 min离心，弃去上清；

1.6 将离心后的沉淀弹散，加入2 ml红细胞裂解液(1X)，室温裂解5 min。

1.7 加等量RPMI 1640完全培养基终止裂红， 200×g, 5 min离心，弃去上清。

2. 小鼠骨髓细胞的极化

2.1用RPMI 1640完全培养基(1640培养基+10%FBS+双抗)重悬细胞至1*106/ml，加入终浓度为20ng/ml的Mouse M-CSF，24孔培养板中加入1ml细胞悬液，此后隔天半量换液，诱导分化6-7天，细胞分化成M0；

2.2 M1方向极化：分化6-7天后，继续加入100ng/ml的LPS和50ng/ml的Mouse IFN-γ，同时还需加入Mouse M-CSF，极化24小时；

2.3 M2方向极化：分化6-7天后，继续加入20ng/ml的Mouse IL-4或和20 ng/ml的Mouse IL-13，同时还需加入Mouse M-CSF，极化24小时；

2.4. 细胞鉴定：购买相应的流式抗体（如F4/80、CD11b、CD80、CD206）进行染色鉴定（M1: CD80+CD206-, M2: CD80+CD206+）。

所需细胞因子：

参考文献：

1. Zajac E, Schweighofer B, Kupriyanova TA, et al. Angiogenic capacity of M1- and M2-polarized macrophages is determined by the levels of TIMP-1 complexed with their secreted proMMP-9. Blood. 2013;122:4054-4067.

2. Murray PJ, Allen JE, Biswas SK, et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 2014;41:14-20.

产品引用文献

· Stigmasterol attenuates inflammatory response of microglia via NF-κB and NLRP3 signaling by AMPK activation.Biomed Pharmacother. 2022 Jun 27;153:113317. (IF 6.529)(Mouse IL-4)

· Decoding the spatial chromatin organization and dynamic epigenetic landscapes of macrophage cells during differentiation and immune activation.Nat Commun. 2022 Oct 4;13(1):5857. (IF 14.919) (Human M-CSF)

· Suppression of PD-L1 release from small extracellular vesicles promotes systemic anti-tumor immunity by targeting ORAI1 calcium channels. J Extracell Vesicles. 2022 Dec;11(12):e12279. (IF 15.48) (Mouse IFN-γ)

· IFNγ Transcribed by IRF1 in CD4 + Effector Memory T Cells Promotes Senescence-Associated Pulmonary Fibrosis. Aging Dis. 2023 Mar 23. (IF 9.968) (Mouse IFN-γ)

· Interferon-α regulates abnormally increased expression of RSAD2 in Th17 and Tfh cells in systemic lupus erythematosus patients.Eur J Immunol. 2023 May 13;e2350420. (IF 6.688) (Human IFN-α, IFN-β, IFN-γ)