1. 人单核细胞获取

1.1 PBMC分离：

采集外周血于EDTA抗凝采血管中，将血液混匀于无菌50ml管中，PBS 1:1稀释血液标本；取干净的50ml管，淋巴细胞分离液、血液、PBS以1:1:1加入，每管15ml分离液，用10ml移液管，沿管壁缓缓加入上述血液稀释液至45ml刻度处，切忌分离液液面波动；室温500g离心30min，升降速度分别调至2和0。根据血液中各组成成分密度的不同，离心后，50ml管内由上而下依次为淡黄色血浆层，单个核细胞白膜层，透明分离液层，及最下方的红细胞层；用移液管轻轻吸去上层血浆层，并将白膜层转移至新的50ml管中，同时加入PBS至50ml，300g离心10min；离心结束后弃上清，弹散管底沉淀，再加入PBS至50ml，300×g离心10min；离心结束后弃上清，将细胞沉淀弹散。

1.2. 单核细胞纯化

单核细胞纯化可采用美天旎生物提供的单核细胞阳选试剂盒或stemcell提供的单核细胞阳性分离试剂盒，具体分离方案参考相应的说明书。

2. 巨噬细胞诱导极化

人的巨噬细胞包括经典活化型巨噬细胞(Classical activated macrophages, M1)及替代活化型巨噬细胞(Alternatively activated macrophages, M2)，显微镜下观察完成分化的细胞形态，M1细胞贴壁最牢，圆形或椭圆形；M2细胞贴壁能力较M1差，呈梭形；DC细胞不贴壁，成簇生长。

2.1 用1640完全培养基(1640培养基+10%FBS+双抗)重悬细胞至1*10^6/ml，加入终浓度为50ng/ml的Human M-CSF，24孔培养板中加入1ml细胞悬液，此后隔天半量换液，诱导分化6-7天，细胞分化成M0；

2.2 M1方向极化：分化6-7天后，加入100ng/ml的LPS和20ng/ml的Human IFN-γ，同时需加入Human M-CSF，极化24小时；

2.3 M2方向极化：分化6-7天后，加入20ng/ml的Human IL-4或者20ng/ml的Human IL-10，同时需加入Human M-CSF，极化24小时；

2.4. 细胞鉴定：购买相应的流式抗体（如CD68、CD80、CD206）进行染色鉴定（M1: CD80+CD206-, M2: CD80+CD206+）。

所需细胞因子：

参考文献

1. Zajac E, Schweighofer B, Kupriyanova TA, et al. Angiogenic capacity of M1- and M2-polarized macrophages is determined by the levels of TIMP-1 complexed with their secreted proMMP-9. Blood. 2013;122:4054-4067.

2. Gao CH, Dong HL, Tai L, Gao XM. Lactoferrin-Containing Immunocomplexes Drive the Conversion of Human Macrophages from M2- into M1-like Phenotype. Front Immunol. 2018;9:37.