小鼠骨髓细胞的分离

1. C57BL/6小鼠（4-12周龄）颈椎脱位处死，70%乙醇消毒5 min。
2. 在超净工作台中取出胫骨和股骨，然后在70%乙醇中浸泡2-5 min以消毒。
3. 用剪刀在关节处剪断骨两端，将用注射器吸取预冷的RPMI-1640完全培养基（RPMI-1640+双抗+10% FBS+2-ME+HEPES），将注射器的针头插入骨腔，将骨腔内的骨髓冲洗到含RPMI-1640完全培养基的无菌培养皿中，反复冲洗2-3次。
4. 收集培养皿中的细胞悬液，用70μm的细胞过滤网过滤去除小碎片和肌肉组织。
5. 将滤过液以1000 rpm 4℃离心5 min，弃上清。
6. 加PBS洗涤一次，1000 rpm离心5 min，弃去上清。

*此处省去了溶血步骤，因为溶血等操作可能会伤害某些DC祖细胞或去除不明确的DC前体的亚群，从而降低最终可能获得的BMDC的产量。

骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的诱导培养

1. 用 RPMI-1640完全培养基重悬上述收集到的细胞，调整细胞密度至2×10^5 cells/ml。铺板到100mm细菌培养皿中。加入重组Mouse GM-CSF，最终浓度为200 U/ml。37℃ 5% CO2培养箱中进行培养。

*这里采用的是细菌培养皿，而不是细胞培养板，因为细菌培养皿表面吸附的改变会阻碍巨噬细胞的生长，而巨噬细胞会影响DC细胞的成熟。因此采用细菌培养皿对于悬浮DC的成熟更有利。

2. 培养第3天，再加入10ml含200 U/ml Mouse GM-CSF的RPMI-1640完全培养基。
3. 第6天和第8天时，半量换液，收集的旧培养基离心去上清后再用10ml新鲜的含200 U/ml Mouse GM-CSF的RPMI-1640完全培养基重悬细胞沉淀，细胞悬液重新放回原培养皿中。
4. 第10天收获悬浮细胞和松散贴壁的细胞，即为BMDC。

*如需去除粒细胞污染，可继续培养，如步骤3进行半量换液，加入新鲜的含30-100 U/ml重组小鼠GM-CSF，培养至第12天，粒细胞的数量将大大减少。

*此时的BMDC为未成熟DC，未成熟状态的DC可能更适合一些实验，如抗原摄取测定，而其他实验可能需要接受更多细胞因子刺激的更成熟的细胞。

BMDC完全成熟培养

1. 收集上述培养第10天BMDC细胞悬液，300g室温离心5 min。弃上清。
2. 细胞沉淀用10ml新鲜 RPMI-1640完全培养基重悬，铺板至100mm细胞培养板中。

*这里改用细胞培养板，因此时BMDC已形成，呈半悬浮状态，残留的巨噬细胞前体可贴附于细胞培养板（对DC的抑制作用减弱），从而使悬液中的DC的纯度更高。

3. 加入重组Mouse GM-CSF（100U/ml）+TNF-α(500U/ml)/LPS(1μg/ml),37℃ 5% CO2培养箱中继续培养1-2天，，即可获得完全成熟的BMDC。

细胞鉴定

取培养细胞悬液，用流式细胞术检测DC细胞表面和胞内MHC-II、CD80、CD86, CD40、CD11c, NLDC-145、CD25等的表达情况。

*采用Lutz法，经LPS或TNF-α处理后预计可获得成熟BMDC的纯度是50-70%，总数量是1–1.5×10^8个/小鼠。

*以上方案仅供参考，​具体以实验情况为准做调整。

参考文献：

1.M B Lutz,  N Kukutsch, A L Ogilvie, etc. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.J Immunol Methods. 1999 Feb 1;223(1):77-92.

2. K Inaba, M Inaba, N Romani,etc. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 1992 Dec 1;176(6):1693-702.

3. Kelly Roney. Bone Marrow-Derived Dendritic Cells. Methods Mol Biol. 2019:1960:57-62.

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产品引用文献

Disulfiram ameliorates STING/MITA-dependent inflammation and autoimmunity by targeting RNF115.Cell Mol Immunol. 2024 Jan 24. (IF 24.1) (Mouse GM-CSF)