1. 人单核细胞获取

1.1 PBMC分离

采集外周血于EDTA抗凝采血管中，将血液混匀于无菌50ml管中，PBS 1:1稀释血液标本；取干净的50ml管，淋巴细胞分离液、血液、PBS以1:1:1加入，每管15ml分离液，用10ml移液管，沿管壁缓缓加入上述血液稀释液至45ml刻度处，切忌分离液液面波动；室温500g离心30min，升降速度分别调至2和0。根据血液中各组成成分密度的不同，离心后，50ml管内由上而下依次为淡黄色血浆层，单个核细胞白膜层，透明分离液层，及最下方的红细胞层；用移液管轻轻吸去上层血浆层，并将白膜层转移至新的50ml管中，同时加入PBS至50ml，300g离心10min；离心结束后弃上清，弹散管底沉淀，再加入PBS至50ml，300g离心10min；离心结束后弃上清，将细胞沉淀弹散。

1.2 单核细胞纯化

单核细胞纯化采用商业化的单核细胞阳选试剂盒，具体分离方案参考相应厂家的说明书。

 2. 破骨细胞诱导分化

2.1 用α-MEM完全培养基(α-MEM培养基+10%FBS+双抗)重悬细胞至5×105/ml，加入终浓度为30ng/ml的Human M-CSF和50ng/ml的Human RANKL；

2.2 按96孔板每孔加入200 μl细胞悬液，加入完成后，左右上下摇晃96孔板几下，在超净台中静止10 min，待细胞沉降后于倒置显微镜下观察是否铺板均匀，铺板均匀后放入37℃培养箱中培养分化；(若是24孔板，可加入1.5~2ml诱导分化)

2.3 每3天更换培养基一次，同时补充新鲜的培养液(含30ng/ml的Human M-CSF和50ng/ml的Human RANKL)，诱导分化10天后即可见开始融合的细胞。

注：细胞因子购买后请按照说明书指示溶解并稀释保存，不可反复冻融，诱导分化培养基请根据每次的用量配置，用多少，配置多少。

培养诱导分化所需的细胞因子

参考文献：

1. Soderstrom K, Stein E, Colmenero P, et al. Natural killer cells trigger osteoclastogenesis and bone destruction in arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107:13028-13033.

2. Lari R, Kitchener PD, Hamilton JA. The proliferative human monocyte subpopulation contains osteoclast precursors. Arthritis Res Ther. 2009;11:R23.

3. Curnow SJ, Fairclough M, Schmutz C, et al. Distinct types of fibrocyte can differentiate from mononuclear cells in the presence and absence of serum. PLoS One. 2010;5:e9730.