破骨细胞及其作用

破骨细胞（Osteoclast，OC）是体内唯一的具有骨吸收活性的多核细胞，具有2-50个细胞核，直径100μm左右。破骨细胞由血液及骨髓中的单核/巨噬细胞系分化而来，其分化过程经历破骨细胞前体（osteoclast precursor cells，OPCs，或称preosteoclasts）、融合的多核破骨细胞（non-functional polykaryons）、成熟破骨细胞（mature osteoclasts，也称极化的多核破骨细胞）等几个阶段。骨骼是一种动态组织，在结构应力和人体对钙的需求等影响下，骨骼不断被分解和重组。破骨细胞是骨骼持续破坏的介质，在骨发育、生长、修复、重建中具有重要的作用。破骨细胞的异常激活会导致骨丢失，常见于如绝经后骨质疏松症或类风湿性关节炎等自身免疫性疾病。

破骨细胞标志物

破骨细胞占据骨头表面的小凹陷，称为Howship腔隙；这种腔隙被认为是由破骨细胞的酶对骨骼的侵蚀引起的。破骨细胞产生许多酶，其中主要是抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acidic phosphatase, Trap），Trap特异地分布于破骨细胞中，为破骨细胞所特有，通常作为鉴别破骨细胞的重要标志物。

破骨细胞的获得

以往破骨细胞通常从新生动物的碎骨中分离，或通过在破骨细胞环境中使破骨细胞前体与成骨细胞共培养而获得的。在过去的十年多中，骨生物学的一个重大突破是确定巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB配体受体激活剂（RANKL）作为破骨细胞分化和活化的必要细胞因子。因此，已经开发了使用重组M-CSF和RANKL从骨髓单核细胞/巨噬细胞谱系细胞中诱导产生成熟和功能性破骨细胞的实验方案。(以下方案供参考)

小鼠骨髓破骨细胞的生成

1. 取6-17周龄小鼠，使用CO2吸入或颈椎脱臼致死。用70%酒精消毒小鼠毛皮。

2. 小心地取出股骨和胫骨，并将其放入10厘米的培养皿中。

3. 无菌条件下准备股骨和胫骨：
a.尽可能使用镊子和剪刀去除所有皮肤、肌腱和肌肉。
b.用手术刀或剪刀切掉所有骨头的两端。
c.使用5ml注射器和23-G针头在新鲜培养皿中用10ml破骨细胞培养基从所有骨头中冲洗出骨髓。丢弃已冲洗的骨骼。
d.使用1ml注射器和27-G针头，通过将细胞悬浮液吸入注射器和从注射器中抽出，尽可能分离细胞聚集体。然后，通过70µm细胞过滤器冲洗细胞悬液，并将其放入50 ml锥形离心管中。
e.用2ml培养基冲洗细胞过滤器的尼龙网

4. 获得的细胞悬液300×g，4°C下离心7min，弃上清。

5. 用5ml红细胞裂解液重悬细胞。冰上裂解10min。

6. 离心，弃上清。再用5ml含10%FBS的 α-MEM培养基重悬，离心，弃上清。

7. 用5ml含M-CSF (25 ng/ml）和10%FBS的 α-MEM培养基重悬细胞。接种于6孔细胞培养板中（每只小鼠一孔），置于37°C、5%CO2细胞培养箱中过夜（14至18小时）。

8. 第二天，吸取培养基，收集未粘附的细胞，注意勿刮擦平板底部。将培养基转移至50ml锥形离心管中。300×g，4℃，离心7min，弃上清。

9. 用5ml含10%FBS的 α-MEM培养基重悬细胞，并使用细胞计数装置计数活细胞。

10. 以1×106cells/ml密度接种于培养板上，并加入M-CSF（50ng/ml）和RANKL（25–100 ng/ml）。

11. 3天后更换培养基。第五天左右一般能观察到多核成熟破骨细胞。

12. TRAP染色鉴定破骨细胞。
 

注意：

a. 使用的RANKL和M-CSF浓度可能因小鼠和实验室条件而异。

b. 从RANKL和M-CSF添加后的第4天起，每天至少观察一次细胞，因为小鼠破骨细胞在完全分化后非常不稳定。破骨细胞形成初期，细胞呈纺锤形，成熟后，细胞变大，多核，呈圆形。与人类破骨细胞相反，小鼠破骨细胞在成熟后24小时内死亡。

由巨噬细胞系RAW264.7诱导破骨细胞

1. 用含10%FBS的α-MEM培养基将RAW264.7细胞制成细胞悬液，以3×10^4 cells/孔的密度接种于24孔板中。

2. 细胞接种12h后，加入RANKL（20-100ng/ml）。

3. 每3天更换培养基，并同时补加RANKL（20-100ng/ml）。

4. 较为明显的多核破骨细胞将在分化培养4天后开始出现，并在第5天至第6天逐渐变得丰富。

5. 进行TRAP染色，鉴定破骨细胞形成情况。
 

注意：

a. RAW264.7细胞在含有10%FBS的RPMI-1640或DEME培养基中可以增殖并保持其分化为破骨细胞的能力，而其在含有10%FBS的α-MEM中培养可进行破骨细胞分化试验。

b. RAW 264.7细胞表达M-CSF及其受体c-fms。因此，仅加入RANKL就足以诱导破骨细胞分化，无需额外加入M-CSF。

相关细胞因子推荐

参考文献

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4. Takahashi N, Udagawa N, Suda T. A new member of tumor necrosis factor ligand family, ODF/OPGL/TRANCE/RANKL, regulates osteoclast differentiation and function. Biochem Biophys Res Commun. 1999 Mar 24;256(3):449-55.

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7. Ulrike Steffen, Fabian T Andes and Georg Schett.Generation and Analysis of Human and Murine Osteoclasts. Curr Protoc Immunol. 2019 Jun;125(1):e74.